RIA

Εισαγωγή

Η τεχνική αναπτύχθηκε το 1960 από τον Berson και την Yallow ως μία δοκιμασία για την συγκέντρωση της ινσουλίνης στο πλάσμα.

Ήταν η πρώτη φορά που τα επίπεδα ορμόνης στο αίμα μπορούσαν να ανιχνευτούν από μία δοκιμασία εργαστηρίου.

Η Yallow πήρε το βραβείο Nobel Ιατρικής το 1977.

Η ακριβής μέτρηση ελάχιστων ποσοτήτων ορμόνης ήταν ένα σημαδιακό γεγονός στην ενδοκρινολογία. Η ραδιοανοσομέτρηση RIA είναι η μητέρα όλων των ανοσολογικών μετρήσεων.

Ορισμός

Η ραδιοανοσοδοκιμασία (RIA) είναι μία ραδιοανοσολογική τεχνική με αξιοσημείωτη ευαισθησία και ένα υψηλό βαθμό ειδικότητας που χρησιμοποιείται ευρέως για την εκτίμηση ποικίλων μορίων που ανευρίσκονται σε σύμπλοκες ενώσεις.

Η ραδιοανοσοδοκιμασία είναι μία εργαστηριακή διαγνωστική τεχνική και επομένως δεν συμπεριλαμβάνει την χορήγηση ραδιενεργούς ουσίας στον ασθενή.

Ραδιοανοσοδοκιμασία (RIA)

Η Ραδιοαονοσοδοκιμασία είναι μία από τα χαρακτηριστικά παραδείγματα τεχνικής ραδιοανίχνευσης χρησιμοποιώντας ένα ραδιοϊσότοπο. Ο ανταγωνισμός ενός αναλύτη με τον ραδιενεργά επεξεργασμένο ανταγωνιστή του για ένα περιορισμένο ποσό αντισώματος, είναι η βασική αρχή αυτής της τεχνικής. Η αύξηση της συγκέντρωσης του αναλύτη αναστέλλει τη σύνδεση του επεξεργασμένου με ραδιενέργεια αναλύτη στο αντίσωμα. Η συγκέντρωση του αγνώστου προκύπτει από τη σύγκριση της ανασταλτικής δράσης της σύνδεσης του ραδιενεργά επεξεργασμένου αναλύτη σε σχέση με εκείνο ενός γνωστού προτύπου (φθίνουσα καμπύλη).

Εν συντομία, το αντιδραστήριο RIA περιέχει δοκιμαστικά σωληνάρια που έχουν επωαστεί με το αντίσωμα. Πρότυπα διαλύματα ή οροί προστίθεται (10-200μl όγκο) μαζί με τον ραδιενεργό ανιχνευτή. Το περιεχόμενο επωάζεται για 1- 5 ώρες και τα σωληνάρια εκκενώνονται με την απόχυση ή αναρρόφηση του περιεχομένου. Τα σωληνάρια πλένονται με το παρεχόμενο πλυστικό διάλυμα και μετριούνται σε ένα μετρητή γ-ακτινοβολίας. Οι κρούσεις που παράγονται από τα γνωστά πρότυπα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία παράγουν μία καμπύλη δόσης-απάντησης και η άγνωστη συγκέντρωση στα δείγματα των ορών εξάγεται από τα δεδομένα της καμπύλης.

Ανοσοραδιολογική Δοκιμασία (IRMA)

Μία πιο ευαίσθητη και ειδική τεχνική είναι η ανοσοραδιολογική δοκιμασία (IRMA), που είναι μία βελτιωμένη μορφή της αρχής RIA. Στην IRMA, ο αναλύτης επωάζεται με ραδιενεργό αντίσωμα που βρίσκεται σε περίσσεια. Η τεχνική IRMA δύο θέσεων, μία περαιτέρω τροποποίηση της τεχνικής IRMA, χρησιμοποιεί δύο αντισώματα (το ένα εκ των οποίων επεξεργασμένο με ραδιενεργό ιώδιο-125) για να κλειδώσει τον αναλύτη δίκην «sandwich». Η IRMA δύο θέσεων έχει καλύτερη ειδικότητα από ότι οι συμβατικές ραδιαονοσοδοκιμασίες.

Η αύξηση της συγκέντρωσης του αναλύτη (αντιγόνου) ενισχύει τη σύνδεση του ραδιενεργού δεύτερου αντισώματος στο σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος. Η συγκέντρωση του αγνώστου προκύπτει από τη σύγκριση της σύνδεσης του επεξεργασμένου αντισώματος σε σχέση με εκείνη ενός κανονικού προτύπου (αύξουσα καμπύλη).

Εξέλιξη της τεχνικής

Η τεχνική RIA έχει υποστεί με τα χρόνια ορισμένες βελτιώσεις ώστε να γίνει πιο φιλική. Η μία εξ αυτών αφορά την εισαγωγή των δοκιμασιών ξηράς φάσης. Ο διαχωρισμός του συνδεδεμένου αναλύτη με το ελεύθερο αναλύτη μετά τη RIA/ IRMA είναι βασική. Σε δοκιμασίες ξηρής φάσης, το αντιδρών αντίσωμα ακινητοποιείται στην ξηρά φάση όπως είναι οι σωλήνες πολυεστυρενίου, και ο διαχωρισμός επιτελείται με απλή απόχυση του περιεχομένου του αντιδρώντος σωληναρίου.

Τα αντισώματα που συνδέονται με μαγνητικά σωματίδια προσφέρουν μία τεχνική φιλική για τον χρήστη και τον παρασκευαστή σε δοκιμασίες ξηρής φάσης. Σ’ αυτή την περίπτωση, το αντίσωμα ζευγαρώνεται με κυτταρίνη ενσωματωμένη σε μαγνητικά σωματίδια. Στο τέλος της επώασης, ο διαχωρισμός του συνδεδεμένου με τον ελεύθερο αναλύτη επιτελείται με την τοποθέτηση της συστοιχίας των δοκιμαστικών σωλήνων σε ένα μαγνήτη, ακολουθούμενος από την απόχυση του ελεύθερου αναλύτη.

Κλινικές Τεχνικές

Η εφαρμογή αυτής της τεχνικής εκτείνεται πάνω από ένα ευρύ φάσμα ουσιών όπως ορμόνες, στεροειδή, βιταμίνες, φάρμακα, ογκολογικοί δείκτες και ιογενή αντιγόνα.

Κλινικές Τεχνικές
Θυρεοειδικές ορμόνες	Διάγνωση θυρεοειδικών παθήσεων.
Ορμόνες γονιμότητας	Διάγνωση γονιμότητας, εγκυμοσύνης, υπογοναδισμού, πρόωρης ήβης και αμηνόρροιας.
Ορμόνες υπόφυσης	Διάγνωση της μεγαλακρίας και των αδενωμάτων της υπόφυσης.
Ορμόνες επινεφριδίων	Διάγνωση του συνδρόμου Cushing’s και της νόσου του Addison.
Καρδιολογικές ορμόνες	Διάγνωση του εμφράγματος του μυοκαρδίου και της συμφορητικής καρδιακής νόσου.
Ιολογία	Ανίχνευση και χειρισμός των ιογενών λοιμώξεων, όπως η ηπατίτιδα.
Ογκολογικοί δείκτες	Διάγνωση και χειρισμός του καρκίνου.
Βιταμίνες	Ανίχνευση βιταμινών στον ορό.
Φάρμακα	Παρακολούθηση των επιπέδων φαρμάκων στον ορό.

Μη κλινικές τεχνικές

Η ραδιοανοσοδοκιμασία λόγω της ευελιξίας της έχει εξαπλώσει τους ορίζοντές της από κλινικές σε μη κλινικές εφαρμογές όπως στην κτηνιατρική, βιομηχανία παραγωγής τροφίμων, βιομηχανία φαρμάκων, ιατροδικαστική και παρακολούθηση περιβάλλοντος.

Οι αφλατοξίνες είναι οι δευτερογενείς μεταβολίτες του μύκητα Aspergillus και είναι η κυρίαρχη μόλυνση των τροφών. Οι αφλατοξίνες είναι δυνητικά καρκινογόνες και επομένως η παρακολούθηση των επιπέδων αφλατοξίνης με RIA είναι επιβεβλημένη στην εξαγωγή τροφικών προϊόντων.

Σύγκριση με άλλες τεχνικές

Πολλές μη ισοτοπικές συνδέσεις έχουν δοκιμαστεί τα τελευταία 30 χρόνια, συμπεριλαμβανομένου της ELISA (ένζυμο ως δείκτης), της χημειοφωταύγειας, ανοσοφθορισμού και άλλων. Πολλοί από αυτοί ισχυρίζονται να είναι καλύτερα των RIA σε μερικούς τομείς, κανένα τους δεν μπόρεσε να αντικαταστήσει εξ’ολοκλήρου τα RIA σε εκτεταμένη κλίμακα. Μερικές από αυτές τις μεθόδους είναι δαπανηρές, μερικές έχουν λιγότερη επαναληψιμότητα και μερικές και τα δύο.

ELISA (Δοκιμασία ανοσοαπορρόφησης μέσω ενζύμου)

Η ELISA περιγράφηκε πρώτη φορά το 1971, και από τότε έχει εξελιχθεί σε σημαντική τεχνική στην διαγνωστική ιολογία. Μία ποσότητα ορού που πιθανόν περιέχει το αντίσωμα αφήνεται να αντιδράσει με το αντιγόνο στόχο. Ένα σωστό ταίριασμα θα προκαλέσει τη σύνδεση του αντιγόνου με το αντίσωμα. Η ανίχνευση γίνεται δυνατή όταν ένα δεύτερο αντίσωμα προστίθεται. Στην ELISA, αυτός ο επεξεργαστής που παράγει ένα ανιχνεύσιμο σήμα είναι ένα ένζυμο (για παράδειγμα υπεροξειδάση). Η προσθήκη ενός υποστρώματος, θα ανιχνεύσει το ποσό του συζευγμένου μέρους από μία διαβάθμιση χρώματος που παράγεται, το οποίο υφίσταται ποσοτικοποίηση.

CLIA (Χημειοφωταύγεια)

Η Χημειοφωταύγεια είναι η παραγωγή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας φωτός από την απελευθερωμένη ενέργεια που προκύπτει από μία χημική αντίδραση. Το φως από αυτές τις αντιδράσεις αποκαλείται ψυχρό φως, γιατί παράγεται χωρίς θερμότητα. Αντιδράσεις που παράγουν φως χωρίς θερμότητα ονομάζονται αντιδράσεις χημειοφωταύγειας.

Τα αντιγόνα και τα επεξεργασμένα αντισώματα με τον ανιχνευτή χημειοφωταύγειας, αφήνονται να αντιδράσουν μεταξύ τους και να σχηματίσουν ένα σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος. Το επόμενο βήμα συμπεριλαμβάνει το διαχωρισμό των συνδεδεμένων από τα ελεύθερα μέρη της αντίδρασης.

Σε αυτά τα αντιγόνα τα συνδεδεμένα με την ουσία χημειοφωταύγειας, κάποιο υπόστρωμα προστίθεται ώστε να αρχίσει η αντίδραση χημειοφωταύγειας. Η χημειοφωταύγεια που παράγεται μετριέται από ένα σωλήνα φωτοπολλαπλασιασμού και ένα φωτόμετρο. Στην βάση της εκπομπής της χημειοφωτάυγειας, εκτιμείται η συγκέντρωση του αναλύτη.

Μία αιτία που δικαιολογεί την αυξανόμενη δημοτικότητα της χημειοφωταύγειας είναι η αξιοπερίεργη ευαισθησία ανίχνευσης. Μερικά μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι αποτελεί ένα κλειστό σύστημα που μετράει φως και ευκολότερα δέχεται παρεμβολές από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός).

Μερικά μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι αποτελεί ένα κλειστό σύστημα που μετράει φως και ευκολότερα δέχεται παρεμβολές από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός).

Tα Μονοκλωνικά αντισώματα (Mabs) της χημειοφωταύγειας έχουν περιορισμένη δυνατότητα αναγνώρισης του επίτοπου συγκρινόμενα με τα πολυκλωνικά αντισώματα (Pabs) που χρησιμοποιούνται στα RIA. Η χημειοφωταύγεια έχει μία τάση να έχει προβλήματα “hook” («αγκίστρου») όταν μετράει υψηλές συγκεντρώσεις αναλυτών (π.χ. προλακτίνη, ογκολογικοί δείκτες, κλπ).

Τυχαία σφάλματα είναι πολύ δύσκολο να ανεβρεθούν και συμβαίνουν συχνά όταν φυσαλίδες αέρα τυχαία παράγονται μέσα στα σωληνάρια του συστήματος, οδηγώντας σε ψευδώς χαμηλές ή ψηλές τιμές.

Εξάλειψη

Με τα χρόνια κύριες ανταγωνιστικές τεχνολογίες έχουν αναδυθεί ικανές να προσφέρουν δοκιμασίες που είναι ίσης κλινικής αξίας, χρησιμοποιώντας μη ραδιενεργές τεχνικές. Παρόλα αυτά, η τεχνική ραδιοανοσοδοκιμασίας είναι ακόμη η μέθοδος προτίμησης για πολλούς. Τα RIA συνεχίζουν να χρησιμοποιούνται ευρέως διεθνώς.

Τα κυρίαρχα πλεονεκτήματα είναι:

Εξαιρετικά ασφαλή και φιλικά προς το περιβάλλον.
Η πιο συγκροτημένη μέθοδος δοκιμασίας.
Οι εκπομπές γάμα ακτινοβολίας δεν επηρεάζονται από τη ζέστη, το δείγμα ή μείγμα ή από το φως. Δεν υπάρχουν παρεμβολές από φαινόμενα που σχετίζονται με το υπόστρωμα.
Οι δοκιμασίες RIA είναι εξαιρετικά οικονομικές.
Τα μηχανήματα RIA είναι πολύ εύχρηστα.
Δεν υπάρχει μέθοδος που να προσφέρει τόσο πολύ μεγάλη ευαισθησία ή ειδικότητα.

Μέλλον

Υπάρχει η εκτίμηση ότι σημαντικός αριθμός εξετάσεων RIA/IRMA διεξάγονται ετησίως παγκοσμίως.

Εξαιτίας της ακεραιότητας τους και της ύπαρξης ανοιχτού συστήματος, τα RIA θα εξακολουθήσουν να υπηρετούν την βασική ανάγκη ενός προγράμματος πρόληψης και διάγνωσης στηριζόμενα στην δομική ανίχνευση των μεταβολών στην συγκέντρωση του αίματος του αναλύτη. Σε μερικές περιπτώσεις, τα RIA θα εξελιχθούν σε δεύτερης γραμμής εξέταση αναφοράς ώστε να συμπληρώνουν τις θυγατρικές της μη ισοτοπικές δοκιμασίες.

Τα RIA θα εξακολουθήσουν να παραμένουν μία διαθέσιμη, οικονομική τεχνολογία μακρά μέσα στον 21ο Αιώνα.

Πεδία Έρευνας

Πολλοί ερευνητές εργάζονται σε πρωτόκολλα με μεθόδους RIA παγκοσμίως. Μερικά πεδία ενδιαφέροντος είναι:

Πεδία Έρευνας
SUBSTANCE	FIELD
Myelin Basic Protein	Νευρολογικές παθήσεις
Precalcitonin	Σηψαιμία
IGFBP-1,2,3,4	Ανάπτυξη
Leptin, Ghrelin, Obestatin, Oxyntomodulin	Μεταβολισμός λιπιδίων, γλυκόζης
PINP, ICTP, PIIINP	Οστικός μεταβολισμός
Chromogranin-A	Νευροενδοκρινείς όγκοι
Adrenomedullin	Καρδιακές, νεφρικές παθ, διαβήτης
Melatonin	Νευροενδοκρινικό σύστημα