Το νεοσυσταθέν μοριακό τμήμα της Βιορμονικής διαθέτει σύνχρονο εξοπλισμό μοριακής βιολογίας για την ανίχνευση του SARS-COVID19. Διαθέτει θάλαμο κάθετης νηματικής ροής για την βέλτιστη προετoιμασία των δειγμάτων προς εξέταση καθώς και κυκλοποιητή της εταιρίας LongGene (Q2000B) εξασφαλίζοντας την ταυτόχρονη και σε πραγματικό χρόνο ανίχνευση ιοικού γενετικού υλικού πολλαπλών γονιδίων. Τα πρωτόκολλα αποστείρωσης και εργασίας έχουν σχεδιαστεί σύμφωνα με τα πρότυπα ασφαλείας BSL-2. Μελλοντικοί στόχοι του εργαστηρίου είναι να συμπεριληφθούν εκτός τους μοριακού διαγνωστικού ελένχου για την νόσο COVID-19 και άλλες ασθένειες με γενετικό υπόβαθρο όπως η κυστική ίνωση καθώς και η ανίχνευση άλλων ιών που προκαλούν λοιμώξεις.
Εισαγωγή
Οι ιοί μπορούν να χαρακτηριστούν και ως υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα, περιέχουν νουκλεϊκά οξέα (DNA ή RNA) και πρωτεΐνες και ορισμένες κατηγορίες επιπροσθέτως διαθέτουν ένα εσωτερικό περίβλημα που απαρτίζεται απο λιπίδια. Οι ιοί δεν αναπαράγωνται δια κυταρρικής διαίρεσης αλλά ανταυτού συντάσσονται και προοικοδομούνται εντός του ξενιστή που μολύνουν. Καθώς δεν διαθέτουν μιτοχόνδρια ή ριβοσώματα καταλαμβάνουν και χρησιμοποιούν το σύστημα του ξενιστή τους για την αντιγραφή τους[1].
Για την κατηγοριοποίηση και την ταξονομία τους ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι αυτό της Βαλτιμόρης. Αυτό το σύστημα κατατάσει τους ιούς βάση του γενετικού τους υλικού και της μετατροπής του σε mRNA. Υπάρχουν 6 κατηγορίες ιοικού γονιδιώματας βάση αυτής της κατάταξης[2].
Oι κορωνοϊοί ανήκουν στην κατηγορία των ελικοειδών ιών με μονόκλωνο RNA γονιδίωμα. Τα έξι λειτουργικά ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF) είναι διατεταγμένα με σειρά από 5′ έως 3′: αντίγραφο (ORF1a/ORF1b), ακίδα (S), περίβλημα (Ε), μεμβράνη (M) και νουκλεοκαψίδιο (Ν). Επιπλέον, επτά υποτιθέμενα ORF που κωδικοποιούν βοηθητικές πρωτεΐνες παρεμβάλλονται μεταξύ των δομικών γονιδίων. Το γονίδιο ρεπλικάσης καλύπτει τα δύο τρίτα του γονιδιώματος 5′ και κωδικοποιεί μια μεγάλη πολυπρωτεΐνη , η οποία διασπάται πρωτεολυτικά σε 16 μη δομικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μεταγραφή και την αντιγραφή του ιού[1].
Το COVID-19 είναι μια ασθένεια που προκαλείται από έναν νέο κορωνοϊό, ο οποίος δεν έχει προηγουμένως εντοπιστεί σε ανθρώπους. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ο COVID-19 προκαλεί ήπια συμπτώματα όπως ξηρό βήχα, κούραση και πυρετό, αν και ο πυρετός μπορεί να μην είναι σύμπτωμα για μερικούς ηλικιωμένους. Άλλα ήπια συμπτώματα περιλαμβάνουν πόνους, ρινική συμφόρηση, καταρροή, πονόλαιμο ή διάρροια. Μερικοί άνθρωποι μολύνονται αλλά δεν εμφανίζουν συμπτώματα και δεν αισθάνονται καλά. Οι περισσότεροι άνθρωποι αναρρώνουν από τη νόσο χωρίς να χρειάζονται ειδική θεραπεία. Περίπου 1 στους 6 ανθρώπους που νοσούν από COVID-19 αρρωσταίνουν σοβαρά και δυσκολεύονται να αναπνεύσουν [3].
Μέθοδος ανίχνευσης
Η απομόνωση νουκλεϊκών οξέων γίνεται βάση της τεχνολογία φιλτραρίσματος σε στήλη γέλης. Το νουκλεϊκό οξύ απορροφάται στη μεμβράνη του φίλτρου από τον δεσμό υδρογόνου και την ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση, ενώ η πρωτεΐνη και άλλες υποπροϊόντα δεν μπορούν να απορροφηθούν. Η απομόνωση του ολικού νουκλεϊκού οξέος (RNA) πραγματοποιείται με υψηλή καθαρότητα χωρίς πρωτεΐνες και άλλες προσμείξεις.
Αφού απομονωθεί το συνολικό RNA, χρησιμοποιείται στην δοκιμασία του RT-qPCR. Το καθαρισμένο νουκλεϊνικό οξύ πρώτα μεταγράφεται αντίστροφα σε cDNA με ανάστροφη μεταγραφάση και στη συνέχεια ενισχύεται με Hot start Taq DNA πολυμεράση στο μηχάνημα της rRT-PCR. Στην ενίσχυση PCR, η δραστηριότητα 5′ νουκλεάσης της Taq DNA πολυμεράσης προκαλεί την αποικοδόμηση του ανιχνευτή TaqMan, προκαλώντας το διαχωρισμό της χρωστικής αναφοράς από τη βαφή σβέσης, δημιουργώντας ένα φθορίζον σήμα. Η μέθοδος εντοπίζει συγκεκριμένα με βάση τους σχεδιασμένους εκκινητές το E και N γονίδιο για τον SARS-CoV-2, ενώ ένα γονίδιο που εκφράζεται σε όλους τους ανθρώπους χρησημεύει ως Εσωτερικός Έλεγχος και έχει σχεδιαστεί με τους δικούς του εκκινητές και είναι αποτελεί σημείο ποιοτικού ελεγχού σε όλη τη διαδικασία.
Σχόλια*
*Η αντίδραση πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένα κιτ για in vitro διαγνωστικούς σκοπούς (CE IVD)
**Η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος πραγματοποιείται σύμφωνα με τη Σύσταση του ΠΟΥ: Εργαστηριακός έλεγχος για τη νόσο του κορωνοϊού 2019 σε ύποπτα ανθρώπινα κρούσματα “από τις 19 Μαρτίου 2020 [3].
***Το σετ εκκινητών και ανιχνευτών SARS-CoV-2 έχει σχεδιαστεί σύμφωνα με την “ενδιάμεση καθοδήγηση του ΠΟΥ για εργαστηριακές δοκιμές για τον νέο κορωνοϊό 2019 (2019-nCoV) σε ανθρώπους”[4].
*** Η μέθοδος ανιχνεύει έως και 5 μετάγραφα ανά αντίδραση και ευαισθησία και ειδικότητα είναι 98% και 97% αντίστοιχα.
**** Το αποτέλεσμα πρέπει να ερμηνεύεται σύμφωνα με την κλινική κατάσταση του ασθενούς και σύμφωνα με τα επιδημιολογικά δεδομένα. Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα μπορεί να είναι αποτέλεσμα χαμηλής συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων, πρώιμης φάσης μόλυνσης, ανεπαρκούς συλλογής δειγμάτων ή διασταυρούμενης αντιδραστικότητας λόγω άγνωστων μεταλλάξεων στο γονιδίωμα του ιού. Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα προσδιορίζονται από τον ΠΟΥ ως δείγματα που αρχικά δηλώθηκαν αρνητικά και κατά τη διάρκεια μιας δεύτερης δοκιμής παρήγαγαν θετικά αποτελέσματα [4,5].
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ :
[1] A.Rahimi, A.Mirzazadeh, S.Tavakolpour : Genetics and genomics of SARS-CoV-2: A review of the literature with the special focus on genetic diversity and SARS-CoV-2 genome detection, Genomics, ISSN 0888-7543, https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2020.09.059.
[2] https://viralzone.expasy.org/254
[3] https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19
[4] https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501
[5] https://www.fda.gov/medical-devices/safety-communications/risk-false-results-curative-sars-cov-2-test-covid-19-fda-safety-communication
Προσωπικό Τμήματος
O Σταύρος Γεωργόπουλος γεννήθηκε στην Πάτρα το 1992 και είναι υιός του αείμνηστου μαέστρου Θοδωρή Γεωργόπουλου.Ολοκλήρωσε τις σπουδές του βασικού πτυχίου Μοριακής Βιολογίας στο Πανεπιστήμιο του Λίβερπουλ το 2014. Ασχολήθηκε κατά τη διάρκεια του dissertation του με τρέχοντες θεραπείες γονιδιακής […]
Η Γεωργία Κουρνούτου είναι Βιολόγος, MSc, PhD. Oλοκλήρωσε τις προπτυχιακές σπουδές της στο τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Η εκπόνηση της διδακτορικής της διατριβής έγινε στο εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Ιατρικής υπό την επίβλεψη του καθηγητή Δ. Καλπαξή, με αντικείμενο […]
Η Παπαδημητρίου – Ολιβγέρη Ιωάννα είναι βιολόγος, κάτοχος του μεταπτυχιακού τίτλου σπουδών “Βιοϊατρικές επιστήμες” και σύντομα ολοκληρώνει τις σπουδές της στο τμήμα Ιατρικής του Πανεπιστήμιου Πατρών. Στα πλαίσια των μεταπτυχιακών της σπουδών έχει λάβει εργαστηριακή εκπαίδευση στο “Nuffield Department of […]
